华东理工发现土霉素生物合成的双组份调控系统

——在龟裂链霉菌M4018中发现一双组份系统RimA1A2，可负调控土霉素合成

研究背景

龟裂链霉菌(S. rimosus)是一类革兰氏阳性丝状放线菌，其主要的次级代谢产物是土霉素，一种经典的广谱性抗生素。龟裂链霉菌作为生产土霉素的工业菌株，其基因组信息日渐完善，土霉素的合成调控也受到广泛研究。

抗生素类次级代谢产物的合成调控方式主要分为两大类: 途径特异性调控和全局调控。目前链霉菌抗生素调节蛋白(SARPs)是研究最为透彻的途径特异性调节因子; 而在全局调控因子中，大部分属于双组份系统。典型的双组份调控系统包含两个蛋白，组氨酸激酶(HK)和响应调节蛋白(RR)，他们的编码基因在基因组上一般是相邻存在的，转录方向相同且往往还是共转录的。其中HK一般位于细胞膜上用以感应外部特定的环境因子，而其对应的RR一般位于细胞质中用以介导细胞响应。作为一类信号转导系统，其作用机理主要是当双组份系统检测到特定的环境信号，细胞膜上的HK上的保守组氨酸残基会实现自我磷酸化，而后将磷酸基团转移到RR蛋白的信号接受域上的天冬氨酸残基，而天冬氨酸的磷酸化导致RR效应结构的构象改变，从而实现信号的传递。最后，构象改变后的RR蛋白与下游靶基因结合，通过蛋白之间的相互作用或直接通过酶的催化作用调控下游途径，从而实现对菌体形态分化或者次级代谢合成等方面的调节(图1)。

图 1典型双组分调控系统的信号传导示意图

在本研究中，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室庄英萍教授和郭美锦教授团队，在S. rimosus M4018中发现了一个新型的双组份调控系统RimA1A2。通过构建其突变菌株，验证了特定培养条件下该双组份系统负调控土霉素合成的机制。这是首次在龟裂链霉菌中发现双组分调控系统，进一步拓展了土霉素的调控网络，这一发现对未来通过代谢工程提高土霉素的产量具有科学指导意义。

研究团队及其发现

华东理工大学庄英萍教授和郭美锦教授联合团队最近在我国生物工程开放获取型期刊(Bioresour. Bioprocess. 2019, 6: 3)上发表研究论文，报道了S. rimosus M4018中一个新的双组份调控系统RimA1A2，并证明它参与了龟裂链霉菌中土霉素的生物合成调控过程。

在这项工作中，作者基于S. rimosus M4018的基因组草图，通过基因组数据分析筛选出一组假定的双组份系统，其与天蓝色链霉菌中已知的双组分系统RapA1A2有一定的同源性。通过基因和蛋白序列比对证实了这一双组份系统的存在，并将其命名为RimA1A2。通过RT-PCR，证明了编码该双组份系统的两个基因是共转录的。因为土霉素的产量与生长过程中产生的色素浓度有一定的正相关性，因此作者通过平板培养即可进行初步筛选，以鉴别细胞生长和产物合成与原始出发菌可能存在差异的双组份突变株。但使用常规的复合培养基(如TSB, R4C, MS, R2YE)，均无法在平板上观察到两者的生长或土霉素合成差异。当在MM培养基中添加特定的氨基酸(如甘氨酸)作为唯一氮源时，可以观察到双组份阻断菌株的土霉素产量显著提高。这说明在培养基依赖条件下，RimA1A2系统能够负调控土霉素的生物合成，且这一结论在液体培养条件下得到进一步确证。接着，在添加甘氨酸为唯一氮源的条件下，还发现双组份系统在不同的环境压力(渗透压和氧化条件)下能够对土霉素的合成产生不同的调控作用。最后，通过qRT-PCR对比分析了土霉素合成中五个关键基因的转录水平，证实了突变株中土霉素合成的变化是由这些合成调控基因转录水平的变化所引起。这些发现表明：在培养基依赖模式下，S. rimosus M4018中双组分系统RimA1A2的确是一个全局调控因子，可以从多方面来调节土霉素的生物合成，并能针对不同的环境压力做出不同的响应。该论文被BIOB主编遴选为二月份重点推荐的论文(https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/).

图 2 该论文研究的技术路线图

BIOB作者简介

庄英萍，博士，华东理工大学生物工程学院教授，博士生导师。围绕着工业生物过程的基础研究，关键共性技术研究和技术推广开展了大量工作，在多尺度发酵过程参数相关分析理论方法基础上，又形成了基于细胞生理特性和反应器流场特性相结合的工业生物过程优化与放大理论与方法及其相关的装备，并在红霉素、头孢菌素C、鸟苷、葡萄糖酸钠、阿维菌素等数十个品种的工业发酵产品中成功应用。庄教授在发酵过程的参数相关分析、发酵过程代谢调控和工业生物过程放大等方面形成了研究特色，近年来获得国家科技进步二等奖3项，上海市科技进步一等奖3项，中国产学研合作创新成果奖1项；发表论文150余篇，SCI收录90余篇，获授权发明专利25项。

郭美锦，工学博士，华东理工大学生物工程学院教授，博士生导师。主要从事工业微生物发酵与过程控制技术研究，以及动物细胞(干细胞)大规模培养与抗体、疫苗的表达技术研究与开发。主要研究方向为：1) 工业微生物发酵生理与分子调控：主要对工业微生物在发酵过程中与培养环境之间的相互作用关系，包括环境条件对微生物细胞在发酵过程的生理变化影响机制，如碳中心代谢途径的改变引起代谢产物的合成效率；同时，研究细胞发酵生理对培养环境的影响，为建立工业化发酵过程控制提供理论基础。2)动物细胞大规模培养工程：主要对CHO细胞、BHK21、HEK293、Vero细胞、干细胞(如骨髓间充质干细胞、小鼠胚胎干细胞、神经干细胞等)、原代组织细胞(如睾丸支持细胞等)等生物反应器大规模培养与抗体(疫苗)工程化技术研究，建立高密度的生物反应器培养技术和在线检测技术，以及大规模生物反应器设计技术研究。

文章来源：Hui Ni (倪辉), Zhiqiang Xiong, Ali Mohsin, Meijin Guo, Hrvoje Petkovic, Ju Chu and Yingping Zhuang. Bioresour. Bioprocess. 2019, 6: 3.