Structure-Guided Tuning of a Hydroxynitrile Lyase to Accept Rigid Pharmaco Aldehydes

华东理工大学许建和团队联合中国科学院上海有机所洪然、林国强团队，通过蛋白质工程方法，理性设计羟腈裂解酶，成功打通这一多年受挫的酶-化学级联合成路线。研究者首先解析了前期获得的巴达木羟腈裂解酶PcHNL5及其与天然底物苯甲醛 (1a) 的复合物晶体结构，基于苯并[1,3][d]二噁烷环相较于苯甲醛的苯环衍生位置，成功鉴别到位于底物通道上的关键残基Leu331，仅凭单位点的突变，便使PcHNL5对目标底物1d的羟腈化活力提高590倍。

研究者通过酶突变体的晶体结构解析和表观动力学研究，发现Leu331位于酶的底物通道上，其侧链残基的形状或大小可能调控PcHNL5的底物适应性。活力测定结果表明，331位氨基酸的侧链变化可调节苯甲醛类衍生物在苯环3,4-位的空间位阻敏感性，而其对底物极性的变化不太敏感。通过构建小而巧的突变体库，将Leu突变为不同的氨基酸 (Trp、Phe、Val、Ala、Gly)，就能实现一系列结构各异的复杂芳香醛的酶促羟腈化，转化效率提升最高达293倍，使得酶促反应的速率远远超过自发羟腈化的速率，从而保证了产物氰醇的高光学纯度。特别值得一提的是，由于PcHNL5通过毕赤酵母实现高效的胞外分泌表达，发酵上清液只需经过简单的酸化 (pH~3.5)，即可直接用于羟氰化反应，非常更适合大规模工业应用中的成本控制要求。在两相酶促反应体系中，β₁-受体阻断剂、镇静剂、β₁-受体激动剂及ACE抑制剂等一系列药物活性分子的前体氰醇得以高效酶促合成。其中，研究者利用突变酶L331A成功开发了首条β₂-受体激动剂(R)-salmeterol的化学-酶法合成路线，从简单的醛1d出发完成酶促羟氰化后，经氢化铝锂还原和溴代物5的N-烷基化，最终在醋酸/水中脱除丙酮叉保护基，以54%的总收率完成了光学纯(R)-salmeterol的克级制备。这也彰显出化学家基于结构分析所理性设计的酶突变体库在构建高效绿色合成途径中的巨大潜力。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.0c01103