新型固定化酶:交联酶-聚合物偶联体展现超常活力和稳定性

研究背景

近年来，有机磷化合物在环境中的积累造成了严重的食品安全和环境污染问题，危害公众健康，受到全球的广泛关切。有机磷酶促降解具有反应速率快、环境友好，无二次污染等优点，在土壤修复、农残降解、日化洗涤等领域具有良好的应用前景。然而，高温、强碱性、高离子强度(表面活性剂)的工业洗涤过程对酶的应用提出了严峻的挑战。如何在苛刻的使用条件下保持酶的催化活力和稳定性是有机磷水解酶亟待解决的一个难题。

酶固定化可以显著提高酶的稳定性，有利于酶的重复使用，降低反应成本。传统的固定化方法需要不同的载体进行共价交联或包埋，由于传质问题造成酶催化活力大幅下降，且载体的使用使固定化过程复杂，成本较高。交联酶聚集体 (cross-linked enzyme aggregates, CLEA)是经典的无载体固定化技术，通过加入戊二醛等双功能交联剂，将聚集(即沉淀)在一起的酶分子相互交联，得到的固定化酶活力回收率和活力密度(单位质量的活力单位)均较高，但由于缺乏载体的稳定作用，酶的稳定性和重复使用率往往不好。更加值得注意的是，酶对离子性表面活性剂很敏感；CLEA尚无法解决洗涤过程中表面活性剂造成的酶失活问题。

研究团队及其发现

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室白云鹏课题组最近在我国生物工程开放获取型期刊(Bioresour. Bioprocess. 2018, 5: 49)上发表研究论文，发展了一种无载体的酶固定化新技术，制备获得的新型纳米交联酶-聚合物偶联体(cross-linked enzyme-polymer conjugates, CLEPC)展现了超出传统方法的优异pH耐受性、热稳定性和催化活力(图1)。

图1. 交联酶-聚合物偶联体制备示意图

在这项工作中，作者提出了改造传统CLEA制备方法的新思路，即在酶聚集沉淀后，加入商品化的聚醚Pluronic F127 (普兰尼克)，使其与酶形成偶联体，再加入戊二醛交联，形成交联酶-聚合物偶联体(图1)。聚醚Pluronic-F127为聚环氧乙烷-环氧丙烷三嵌段聚合物，前期研究表明其疏水嵌段可与酶表面结合，稳定酶的构象，提高游离的有机磷水解酶的催化活力，但尚不清楚它是否对固定化酶也能起到相同效果。为了验证该方法的可行性和有效性，作者利用前期开发的有机磷水解酶PoOPHM9 (J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 9094)，制备了PoOPHM9-CLEPC并对其催化特性进行了深入研究。结果表明，PoOPHM9-CLEPC在pH7.0-11.0范围内相对活力均高于游离酶，最适反应温度从30℃提高到50℃ (图2 a, b)。PoOPHM9-CLEPC在50℃下的半衰期达到了12.8 h，显著优于游离酶(0.5 h)和传统方法制备的CLEA (7.2 h)，表明其热稳定性大幅提高(图2c)；其催化效率kcat/Km 为390.3 ± 7.8 mM-1 s-1，也优于CLEA (10.9 ± 1.7 mM-1 s-1)。尤其值得注意的是，CLEPC在0.1% (w/w)的阴离子去污剂SDS、非离子型去污剂烷基聚葡糖苷APG、生物相容性去污剂椰子油衍生物COD存在下，催化活力不但没有降低，相反提高了2到2.5倍(图2d)；对比实验表明在表面活性剂存在下聚醚PF127对酶具有保护和活力激活效应。进一步的生物降解实验验证了PoOPHM9-CLEPC在50℃和表面活性剂存在下对马拉硫磷的降解速率高于游离酶和常规的CLEA。本项目发展的纳米交联酶-聚合物偶联体同时提高了酶的活力和稳定性，方法简单，成本低，有望应用于食品安全和环境污染物的降解领域，也可拓展用于其他酶的固定化。该研究工作受到科技部重点研发计划和国家自然科学基金青年项目的资助，清华大学戈钧教授、华东理工大学生物工程系张晓彦为论文的共同通讯作者。

图 2 PoOPHM9-CLEPC具有优异的催化特性

该论文被BIOB主编遴选为三月份重点推荐的论文(https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/).

BIOB作者简介

白云鹏，华东理工大学生物工程学院副教授。清华大学化工系工学学士(高分子，2004年)，理学硕士(化学，2007年)，英国剑桥大学博士(化学，2011年)，瑞典皇家理工学院博士后(2012-2014)。现任华东理工大学生物工程系主任，生物反应器工程国家重点实验室固定人员，九三学社上海市委教育专门委员会委员，上海市生物工程学会合成生物学专业委员会委员，2015年入选上海市浦江人才计划。主要从事绿色合成化学、环境生物技术、超分子生物催化方面的研究。具体包括：1)采用生物信息学和蛋白质工程工具，发现和改造结构新颖、功能独特的酶，构建新的催化反应，实现生物医药和食品领域高附加值化学品(如手性内酯、中长链二元酸)的高效、绿色合成；2)发展基于液滴微流控和生物传感器的高通量蛋白质改造技术，研发检测和降解有机磷农药、塑化剂、阻燃剂、微塑料的酶催化剂和环境治理工艺；3)构建具有纳米复合效应的无机-酶纳米复合催化剂，研究纳米效应调控的酶催化机理，探索体外多酶催化级联反应的应用。

作为负责人主持科技部重点研发计划青年项目子课题、国家自然科学基金青年项目、上海市自然科学基金、上海市浦江人才计划等项目；作为主要研究骨干参与国家自然科学基金重点项目。近年来在PNAS, Lab Chip, J. Agric. Food Chem., Sensor Actuat B-Chem等期刊上发表SCI论文30余篇，申请中国发明专利5项，已授权专利1项，担任RSC Adv., ChemBioChem, Bioresour. Bioprocess.等期刊审稿人。

文章来源：Huan Cheng, Yu-Lian Zhao, Xiao-Jing Luo, Dian-Sheng Xu, Xun Cao, Jian-He Xu, Qing Dai, Xiao-Yan Zhang*, Jun Ge* and Yun-Peng Bai*. Cross-linked enzyme-polymer conjugates with excellent stability and detergent-enhanced activity for efficient organophosphate degradation. Bioresources & Bioprocessing, 2018, 5, 49.